細胞凋亡是一種在基因控制下的細胞主動死亡過程，通常表現(xiàn)為核濃縮，起皺，膜發(fā)泡以及 DNA pian段化。WB 是研究細胞凋亡機理的基本方法之一，但是 WB 也不是誰都能做成功的，因為有可能你的步就做錯了！用 WB 做細胞凋亡研究樣品制備是步，樣品制備方法至關重要否則會得到錯誤的結果和結論。
樣品制備，看你是不是這樣做的：
自配裂解液或者購買 RIPA，加上樣品研磨啊研磨，孵育啊孵育，然后離心扔掉沉淀（RIPA 不可溶組分），取上清（RIPA 可溶組分）進行下游實驗。
對對對！都是這么做啊，扔了取上清！
且慢，我們扔掉了，扔掉了，扔掉了一些啥？要不要緊，影響細胞凋亡的實驗結果不？
例一． Zapata et al., （1998）. Granzyme Release and Caspase Activation in Activated Human T-Lymphocytes. J Biol Chem 1998, 273:6916-6920.
Caspase 家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中 caspase-3 為關鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3 正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的 Caspase-3 由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase 的活性明顯下降。
? 研究方法
1. 分別使用 RIPA 和 2%SDS + 超聲提取未激活 T 淋巴細胞（Lanes 1 和 5）和激活的 T 淋巴細胞（Lanes 2-4 和 6-8）裂解細胞提取總蛋白
2. WB 進行 caspase-3, caspase-7, parp and GD1 檢測
? 主要發(fā)現(xiàn)
p24, p20 存在于 RIPA 提取的蛋白中，但 Laemmli 裂解液提取的蛋白中卻不存在。證明了 RIPA buffer 提取蛋白時會人工激活 caspase-3 and caspase-7。用 Laemmli 緩沖液加超聲處理可進一步從 RIPA 不可溶性組分中提取出蛋白。
例二．Kevin A. Janes,(2016).An Analysis of Critical Factors for Quantitative Immunoblotting. Sci Signal. ; 8(371): rs2. doi:10.1126/scisignal.2005966.
? 研究方法
1. MCF10A-5E 人ru腺上皮細胞激活 Fas 死亡受體，無激活組為對照
2. 分別用 NP-40（不含 SDS 和脫氧膽酸鹽），RIPA buffer， Laemmil（SB）樣品緩沖液提取蛋白
3. WB 進行 Clv-caspase-8 檢測, Hsp90,Tubulin，P38 作為對照
? 主要發(fā)現(xiàn)
結果顯示，僅在 Laemmil 緩沖液提取的樣品中檢測到激活形式的 Caspase-8，而使用 NP-40 和 RIPA 提取的蛋白樣品中均未檢測到。證明了 RIPA buffer 提取的蛋白并非是完整的蛋白譜，某些特定蛋白會因刺激方式在可溶性和不可溶性組分之間移動。
例三．CHO HEE KIM1 et al,(2010).Role of reactive oxygen species-dependent protein aggregation in metabolic stress-induced necrosis. INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY 37: 97-102,2010
? 研究方法
1. MDA-MB231 細胞，分別用 shCon，shSnail 質粒轉染，分別培養(yǎng)于普通培養(yǎng)基及 GD 培養(yǎng)基 12 小時
2. 使用 RIPA 提取蛋白，分別將 RIPA 可溶性組分和 RIPA 不可溶性組分進行 Snail, p53, pro-caspase 3, pro-caspase 9, and beclin 1，WB 檢測。
? 主要發(fā)現(xiàn)
某些特定刺激誘導凋亡后，P53，caspase3，caspase9 等會聚集在 RIPA 不可溶組分中，不可溶性組分中 P53 和 caspase 9 信號甚至比可溶性組分中更強，表明目標蛋白在 RIPA 不可溶組分中顯著丟失。證明 RIPA 并不能提取到真正意義上的總蛋白，丟掉的不可溶組分中還有很多蛋白，甚至是目標蛋白。
例四 .SU YEON LEE，et al（2010）.Implication of necrosis-linked p53 aggregation in acquired apoptotic resistance to 5-FU in MCF-7 multicellular tumour spheroids. ONCOLOGY REPORTS 24: 73-79, 2010
? 研究方法
1. MCF-7 細胞培養(yǎng) 4-9 天后，用 RIPA 分別進行蛋白提取，分為 RIPA 可溶性組分和不可溶性組分兩組
2. SDS-PAGE 后，立春紅染色（圖 A），用 WB 分別檢測 p53，CuZnSOD，MnSOD，Tubulin（圖 B）
? 主要發(fā)現(xiàn)
MTS 培養(yǎng)過程中，RIPA 不可溶性組分中蛋白增加，可溶性組分和不可溶性組分蛋白圖譜有很大差異，胞漿中的 CuZnSOD 和線粒體中的 MnSOD 只存在于 RIPA 可溶性組分中，而 p53 和 tubulin 則在 RIPA 可溶性和不可溶性組分中都存在。這表明，如果僅使用可溶性組分研究目標蛋白的定量，則結論可能是不準確或出現(xiàn)偏頗。
看了一圈下來，細胞凋亡 WB 沒成功的原因，很可能就是因為你用了 RIPA！
RIPA 不適合做細胞凋亡 WB 檢測的原因
1. RIPA buffer 提取蛋白時會人工激活 caspase-3 and caspase-7。
2. RIPA buffer 提取的蛋白并非是完整的蛋白譜，目標蛋白及內參蛋白常常會丟失在被丟棄的不可溶組分中，僅使用可溶性組分研究不嚴謹。
3. RIPA buffer 提取的蛋白圖譜偏差會得出錯誤或偏差結論，特別是涉及目標蛋白的定量問題時。
