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細胞凍存及復蘇的基本原則和原理
點擊次數(shù):213 更新時間:2024-12-17

細胞凍存及復蘇的基本原則和原理

細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融,實驗證明這樣可以最大限度的保存細胞活力。如今細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑,這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性,加上緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外,減少細胞內(nèi)冰晶的形成,從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復蘇細胞應采用快速融化的方法,這樣可以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化,避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損傷。

細胞凍存的基本步驟

(一)細胞凍存

1.配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液;

2.取對數(shù)生長期的細胞,去除舊培養(yǎng)液,用PBS清洗。

3.去除PBS,加入適量胰i蛋白酶(覆蓋培養(yǎng)皿表面)把單層生長的細胞消化下來;

4.離心1000rpm,5min;

5.去除胰i蛋白酶,加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液,用吸管輕輕吹打使細胞均勻,計數(shù),調(diào)節(jié)凍存液中細胞的最終密度為5×106/ml~1×107/ml;

6.將細胞分裝入凍存管中,每管1~1.5 ml;

7.在凍存管上標明細胞的名稱,凍存時間及操作者;

8.凍存:標準的凍存程序為降溫速率-1~-2℃/min;當溫度達-25℃以下時,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃時,則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h,然后放入-70℃冰箱中過夜,取出凍存管,移入液氮容器內(nèi)。

(二)細胞復蘇

1.從液氮容器中取出凍存管,直接浸入37℃溫水中,并不時搖動令其盡快融化。

2.從37℃水浴中取出凍存管,打開蓋子,用吸管吸出細胞懸液,加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液,混勻;

3.離心,1000rpm,5min;

4.棄去上清液,加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細胞,計數(shù),調(diào)整細胞密度,接種培養(yǎng)瓶,37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng);

5.次日更換一次培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)。

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