蛋白質(zhì)組實(shí)驗(yàn)流程的樣品制備原則

    樣品制備是雙向電泳中zui關(guān)鍵的一步，將直接影響2-DE結(jié)果好壞。目前并沒(méi)有一個(gè)通用的樣品制備方法，盡管處理方法多種多樣，但都遵循幾個(gè)基本的原則：1）盡可能的提高樣品蛋白的溶解度，抽提zui大量的總蛋白，減少蛋白質(zhì)的損失；2）減少對(duì)蛋白質(zhì)的人為修飾；3）破壞蛋白質(zhì)與其他生物大分子的相互作用，并使蛋白質(zhì)處于*變性狀態(tài)。

    根據(jù)這一原則，樣品制備需要四種主要的試劑：離液劑(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性劑（sufactants），也稱去垢劑，如CHAPS與Zwittergent系列等雙性離子去垢劑；還原劑（reducingagents），zui常用的是二硫蘇糖醇（DTT）和磷酸三丁酯（TBP）等。當(dāng)然，也可以選擇性的加入Tris-base,蛋白酶抑制劑以及核酸酶。

    樣品的來(lái)源不同，其裂解的緩沖液也各不相同。通過(guò)不同試劑的合理組合，以達(dá)到對(duì)樣品蛋白的zui大抽提。在對(duì)樣品蛋白質(zhì)提取的過(guò)程中，必須考慮到去除影響蛋白質(zhì)可溶性和2DE重復(fù)性的物質(zhì)，比如核酸、脂、多糖等大分子以及鹽類小分子。大分子的存在會(huì)阻塞凝膠孔徑，鹽濃度過(guò)高會(huì)降低等電聚焦的電壓，甚至?xí)p壞IPG膠條，這樣都會(huì)造成2-DE的失敗。樣品制備的失敗很難通過(guò)后續(xù)工作的完善或改進(jìn)獲得補(bǔ)償。

    核酸的去除可采用超聲或核酸酶處理，超聲處理應(yīng)控制好條件，并防止產(chǎn)生泡沫；而加入的外源核酸酶則會(huì)出現(xiàn)在zui終的2D膠上。脂類和多糖都可以通過(guò)超速離心除去。透析可以降低鹽濃度，但時(shí)間太長(zhǎng)；也可以采取凝膠過(guò)濾或沉淀/重懸法脫鹽，但會(huì)造成蛋白質(zhì)的部分損失。

    因此，樣品制備方法必須根據(jù)不同的樣品、所處的狀態(tài)以及實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵髞?lái)進(jìn)行選擇。目前有很多方法適于2-DE，如組織或細(xì)胞的總蛋白提取物、亞細(xì)胞組份或細(xì)胞器蛋白、免疫沉淀的蛋白及其它亞組份蛋白（如磷酸化蛋白、采用親合純化凝集素結(jié)合蛋白等）。

    一、細(xì)胞樣品
    1.細(xì)胞培養(yǎng)，加藥與處理。
    2.胰酶消化貼壁細(xì)胞，PBS漂洗3次(1500ｇ，5min)，棄上清,再次離心，去盡殘液（非常重要！）。如要比較細(xì)胞膜蛋白組的差別，用細(xì)胞刮收獲細(xì)胞。如用10mMTris/250mMSucrose(pH7.0)代替PBS，可有效降低樣品的鹽濃度。
    加入5倍體積裂解液，混勻（或?qū)?×106細(xì)胞懸于60～100µl裂解液中）。
    3.加50ug/mlRNase及200ug/mlDnase，在4℃放置15分鐘。
    4.15,000轉(zhuǎn)，4℃離心60分鐘（或40,000轉(zhuǎn)，4℃離心30分鐘）。
    5.收集上清。
    6.測(cè)定蛋白濃度(采用BioRadRC/DCproteinassaykit)。
    7.分裝樣品，凍存于－70℃。

    二、組織樣品
    1.碾缽碾磨組織，碾至粉末狀。
    2.將適量粉末狀組織轉(zhuǎn)移至勻漿器，加入適量裂解液，進(jìn)行勻漿。
    3.加50ug/mlRNase及200ug/mlDNase，在4℃放置15分鐘。
    4.15,000轉(zhuǎn)，4℃離心60分鐘（或40,000轉(zhuǎn)，4℃離心30分鐘）。
    5.收集上清，測(cè)定蛋白濃度。
    6.分裝樣品，凍存于－70℃。

    注意事項(xiàng)：
    1.8mmol/LPMSF必須在添加還原劑之前用，否則PMSF會(huì)失去活性。
    2.40mmol/L濃度以下的Tris可使有些蛋白酶在高pH值下失活。
    3.細(xì)胞清洗――大多用PBS，若PBS殘留于細(xì)胞表面會(huì)造成膠上出現(xiàn)水平條紋，則可利用(10mmol/LTris,250mmol/LsucrosepH7.0)來(lái)解決此問(wèn)題。